要檢測一個基因的表達產(chǎn)物是否正確，或者比較表達產(chǎn)物量的相對變化，**方法是Western Blot。因為Western Blot操作相對簡單方便，既可以定性分析表達產(chǎn)物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦、假陽性啦、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有 活性的生物大分子，抗體和抗原的反應畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產(chǎn)物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴謹 的Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結(jié)果分析是非常有用。特別是當實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨 天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應的分子量大小），空白載體對照（如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照），已 知量標準產(chǎn)物的正對照；另外還有內(nèi)參。可是由于經(jīng)費限制或者偷懶的原因，國內(nèi)的不少人做Western Blot往往省略參照，導致結(jié)果出現(xiàn)問題時無法分析結(jié)果――即便有結(jié)果也可能影響結(jié)果的分析。

        內(nèi)參是**容易被忽略的一項。我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以你需要內(nèi)參。

        內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內(nèi)參的檢測，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性。

        在國外發(fā)表的文章中，Western Blotting 實驗結(jié)果須進行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的**方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的準確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA 的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度**高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其**主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。另外，蛋 白質(zhì)定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內(nèi)參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。

        在Western Blotting中使用內(nèi)參其實就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對應的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達，由于內(nèi)參在各組織和細胞 中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否 完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

        實 驗結(jié)果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉(zhuǎn)膜實驗時，分別檢測樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得 到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數(shù)值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結(jié)果。如果樣品量充分， 可以先檢測內(nèi)參，觀測樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，**內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結(jié)果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹?shù)墓ぷ鳌?br />
        附：在Western Blotting實驗過程中使用內(nèi)參的方法有：

        一、 超級簡便的標記內(nèi)參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。

        二、普通內(nèi)參：當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內(nèi)參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

        三、當目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內(nèi)參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。