Western Blot 又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的基于抗體抗原之間特異免疫反應(yīng)的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。

其基本原理為：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應(yīng)或者化學(xué)發(fā)光等方法將目標蛋白可視化，從而對蛋白進行定性或者定量研究。

抗體與抗原之間的特異性識別是 Western Blot 實驗中**為關(guān)鍵的一個步驟，選擇的抗體是否合適、抗體的質(zhì)量優(yōu)劣都關(guān)乎實驗的成敗。下面將從高品質(zhì)抗體的選擇、驗證數(shù)據(jù)對抗體的重要性及內(nèi)參抗體的選擇標準等方面給大家一些建議。

質(zhì)量是甄選優(yōu)質(zhì)抗體的首要標準

2015 年，刊登在 Nature 的一篇文章深度闡述了目前抗體試劑的現(xiàn)狀與問題，給全世界科研工作者敲響了警鐘。當抗體試劑遭遇信任危機，我們更應(yīng)深刻反思：如何才能獲得高質(zhì)量、合適的抗體試劑。（查看全文）

市面上常見的抗體有進口品牌、國產(chǎn)品牌、進口品牌國內(nèi)分裝這幾種類型。大部分進口品牌在抗體的質(zhì)量、特異性、效價及保存條件方面較有保障。而有些國產(chǎn)品牌的抗體，在做 Western Blot 時，由于其特異性不高，導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)背景不干凈，非特異性條帶多等問題。進口品牌國內(nèi)分裝則是個別經(jīng)銷商從廠家買到產(chǎn)品后，再通過稀釋、分裝、重新貼牌之后賣給客戶，這樣的抗體雖然價格相對便宜，但質(zhì)量良莠不齊，批間差異較大。

要確保抗體的高質(zhì)量，我們通常是選擇可信賴的品牌，此外，還應(yīng)注意抗體的供應(yīng)商渠道是否正規(guī)，其供應(yīng)鏈物流是否專業(yè)。綜合這幾方面因素，Sigma-Aldrich 都是不錯的選擇。Sigma-Aldrich 是國內(nèi)**早實行電子商務(wù)的生命科學(xué)產(chǎn)品供應(yīng)商，并以直銷為主導(dǎo)，避免了中間流通環(huán)節(jié)的問題，加上其強大的物流體系，很大程度上降低了銷售環(huán)節(jié)可能帶來的實驗風(fēng)險。

完善的驗證數(shù)據(jù)是抗體選擇的必要參考

優(yōu)質(zhì)抗體還應(yīng)具備完善的驗證數(shù)據(jù)和詳細的信息標注，比如：是否明確標注其可以用于 Western Blot、是否有足夠的數(shù)據(jù)支持證明該抗體適用于某一組織或者樣本、是否有明確的抗體建議稀釋濃度、該抗體的識別位點是連續(xù)的氨基酸序列的一級結(jié)構(gòu)還是非連續(xù)性氨基酸的三維結(jié)構(gòu)位點……這些信息和數(shù)據(jù)的真實性及完整性是保證 Western Blot  實驗順利進行的關(guān)鍵。

關(guān)于這一點，HPA 金標抗體及其所提供的數(shù)據(jù)是一個很好的案例。HPA 抗體數(shù)據(jù)庫覆蓋了人類 85% 的蛋白，每支抗體均通過嚴格的抗原序列篩選及親和層析純化流程，確保其特異性和純度。此外，每支抗體在多種組織樣品中經(jīng)過蛋白芯片、Western Blot、免疫組化、免疫熒光等實驗的驗證，并獲得學(xué)術(shù)委員會的認證。作為重要的參考數(shù)據(jù)，所有的實驗驗證、發(fā)表文獻和生物信息學(xué)預(yù)測都公布在 proteinatlas.org 網(wǎng)站供大家免費查詢。完善的實驗數(shù)據(jù)支持可避免因信息不完整而造成的選擇錯誤。

有效的內(nèi)參抗體是實驗準確的重要憑證

在 Western Blot 中，內(nèi)參是由持家基因編碼表達的蛋白（Housekeeping Proteins），在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用來做參照物。借助內(nèi)參校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，是證明 Western Blot 實驗結(jié)果真實可靠的重要憑證。一些常見的內(nèi)參基因及抗體包括 β-actin、GAPDH、PCNA、α-Tubulin 等。

值得注意的是，不同的內(nèi)參抗體只適用于一定范圍的樣本和組織，我們需要查閱參考文獻，并根據(jù)樣本和組織的差別選擇合適的內(nèi)參抗體，以確保實驗的準確性。（如下表所示）

內(nèi)參抗體選擇標準	參考依據(jù)（貨號為 Sigma 公司推薦）
根據(jù)目的蛋白種屬來源	哺乳動物：GAPDH（G8795）、β-actin（A5441）、β-tublin（T2200）
	植物：Plant actin（A0480）、Rubisco（R8000）
目的蛋白分子量大小	一般同內(nèi)參相差5kDa
目的蛋白的定位	核定位蛋白：Lamin B（L9393）、TBP、Histone H3（H9289），PCNA（WH0005111M2）
	膜定位蛋白：Na/K ATPase（A276）
	線粒體定位蛋白：VDAC1/膜孔蛋白（AV35122） 、COX IV
	胞質(zhì)定位蛋白：GAPDH、β-actin、β-tublin （同樣適用于全細胞樣品檢測）
特異性及具體實驗?zāi)康?/td>	β-actin 在肌肉組織中含量很少
	細胞增殖實驗中，c-Jun 由于自身表達變化就不適合做內(nèi)參
	凋亡檢測時，不適宜選擇LaminB、TBP 等作為內(nèi)參

在 Western Blot 中如果抗體選擇或使用不當，可能會造成無信號、弱信號、高背景、有雜帶等實驗問題，下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案，供參考。

實驗問題	原因	解決方案
無信號或信號弱	一抗不純或特異性低	重新選擇或制備高特異性的抗體，純化抗體
	抗體不工作	設(shè)置對照，分別檢查一抗、二抗是否能正常工作；檢查一抗及二抗種屬來源及亞型，正確選擇抗體
	抗體濃度低，孵育時間短	增加抗體孵育時間；降低洗滌強度。
背景高	一抗?jié)舛雀?/td>	優(yōu)化抗體濃度，推薦使用單抗
	二抗?jié)舛雀?/td>	增加抗體的稀釋倍數(shù)
非特異性條帶	一抗不純或特異性低	重新選擇或制備高特異性的抗體，純化抗體
	二抗非特異性	只設(shè)置二抗對照，評估二抗影響
反影或條帶為黃色	二抗?jié)舛雀?/td>	增加抗體的稀釋倍數(shù)

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以上是關(guān)于 Western Blot 實驗過程中如何選擇合適的、高品質(zhì)抗體的一些建議，以及由于抗體選擇和使用不當而造成實驗失敗的問題總結(jié)，希望能給大家一些幫助和啟發(fā)。此外， Western Blot 還有很多關(guān)鍵的實驗環(huán)節(jié)需要注意，比如怎樣制備高質(zhì)量的蛋白樣品、怎樣保護蛋白樣品不被降解、怎樣配制合適的 SDS-PAGE  凝膠等，在之后的篇章里會逐步為大家介紹。